KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut di antara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

Fase diam (Stationary phase)

Fase diam merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi, karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

Fase gerak (Mobile phase)

Fase gerak merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut.

JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

 Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu gas chromatography dan liquid chromatography.

1. Kromatografi Gas

a. GLC (Gas Liquid Chromatography)

b. GSC (Gas Solid Chromatography)

                 

 

2. Kromatografi Cair

a. HPLC (High Performance Liguid Chromatography)

b. LLC-PC (Liquid Liquid Chromatography - Paper Chromatography)

c. LSC-TLC (Liquid Solid Chromatography - Thin Layer Chromatography), Kolom

d. Ion Excange

e. Ekslusi : - GP (Gel Permeation)

      - GF (Gel Filtration)

Liquid Liquid Chromatography (LLC)

LLC adalah kromatografi pembagian di mana partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak.

Umumnya sebagai fase diam digunakan air dan sebagai fase gerak adalah pelarut organik. Misalnya pada kromatografi kertas, sebagai fase diam adalah air yang terserap pada serat selulosa dari kertas.

Liquid Solid Chromatography (LSC)   

LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini.

Ion-exchange chromatography

Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion. Senyawa yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan. Analisa asam-asam amino adalah yang umum dilakukan dengan cara ini. Contoh lain adalah asam-asam nukleat dan analisis garam-garam anorganik.

Exclusion chromatography

Dalam teknik ini, gel non ionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM).      

Molekul-molekul yang kecil akan memasuki pori-pori dari gel sedangkan molekul besar akan melewati sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan dengan molekul yang melewati pori-porinya. Jadi urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih besar, molekul sedang, dan terakhir molekul yang paling kecil. Bila sebagai penyaring digunakan gel yang hidrofil (Sephadex) maka teknik ini disebut gel filtration chromatography dan bila digunakan gel yang hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut gel permeation chromatography.

Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan high performance liquid chromatography (kromatografi cair kinerja tinggi / KCKT).

Pemisahan dengan kromatografi

Pemisahan dengan kromatografi sendiri lebih baik daripada ekstraksi, karena sering diibaratkan dengan corong pisah yang saling berhubungan yang bergerak dari atas ke bawah dimana pada setiap corong pisah terjadi pemisahan. Selain itu permukaan antar fase pada kromatografi lebih besar. Waktu retensi (tR) adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari awal kolom sampai ke detector. Semakin lama analit berinteraksi dengan fase diam –> semakin lama ia keluar –> tR semakin besar, sehingga ada suatu konstanta yang menyatakan kecepatan migrasi solut melalui fase diam. Kecepatan migrasi solut dipengarui oleh perbandingan distribusinya (Kd atau kadang disebut D) yang ditentukan oleh afinitas relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak:

Kd = Kadar senyawa dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerak

Dari persamaan tersebut dapat ditarik kesimpulan kalo semakin besar harga Kd suatu senyawa maka waktu retensinya (tR) akan semakin besar karena interaksi dengan fase diam besar dan migrasinya semakin lambat.

 Parameter kinetika pemisahan

Faktor Selektifitas (α)

Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-senyawa dalam campuran. Untuk mendapat selektifitas yang maksimum maka harus dicari interaksi yang sesuai (apakah partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Faktor selektifitas (α) dapat dicari dengan:

α = k2/k1 = (tR2-tm)/(tR1-tm)

Apabila kedua senyawa memiliki nilai K yang sama / α = 1 maka kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. karena waktu retensinya identik.

Faktor Spesifisitas (Kd)

Sifat spesifisitas dari kromatografi didasarkan pada sifat dari senyawa yang spesifik. Senyawa memiliki sifat spesifik karena memiliki Kd yang spesifik.

Kapasitas Kolom (K’)

Menunjukkan kemampuan kolom menampung analit. Semakin lama analit berada dalam kolom, akan semakinb esar nilai kapasitasnya. Nilai K’ yang bagus antara 1-10. Jika k’ terlalu kecil, kemungkinan pemisahannya belum sempurna dan jika terlalu besar maka akan terjadi pelebaran puncak.

Resolusi (Rs)

Untuk taraf kepercayaan 95%, harga Rs yang baik adalah > 1,5. Jika kurang dari ini maka puncak dari masing2 analit akan saling tumpang tindih

Jumlah Lempeng Teoritis (Neff)

Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi.

Interaksi Analit dan Fase diam

Setelah tahu tentang konsep pemisahan nyambung kesini. Sebenarnya secara sederhana mekanisme pemisahan analit dibedakan menjadi 4, hal ini yang mengakibatkan perbedaan waktu retensi karena perbedaan interaksi analit dengan fase diamnya.

1. Adsorbsi

Fase diam: Padatan

Fase gerak: Cair (bisa juga gas pada Kromatografi padat-gas)

Dasar pemisahan: Stereokimia

2. Partisi

Fase diam: Cair

Fase gerak: Cair atau gas (pada kromatografi cair-gas)

Dasar pemisahan: Partisi-konsep like dissolves like

Untuk kromatografi jenis ini dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika kimia dengan fase diam akan tertambat lebih lama pada fase diam –> tR lebih besar

Sebagai contoh jika kita ingin memisahkan kafein dan parasetamol pada sampel obat flu (kaya praktikum HPLC hehe) dengan fase diam ODS (Oktadesil silika) yang nonpolar. maka parasetamol akan lebih dulu keluar dari kolom atau tR lebih kecil daripada kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan lebih terlarut pada fase diam. sedangkan parasetamol bisa terlarut dikit tp cuma sebentar.

3.  Penukar ion (bahasa kerennya: ion exchange)

mekanisme pemisahan karena interaksi ionik antara fase diam dan solut. biasanya dipake di pabrik farmasi untuk bikin air bebas ion (sori lupa namanya haha). berdasarkan muatan yang dilapiskan pada fase diam, dapat dibagi 2:

a. Penukar anion: Fase diamnya muatan positif sehingga yang bermuatan negatif akan ketarik fase diam

b. Penukar kation: Fase diamnya bermuatan negatif sehingga yang bermuatan positif akan ketarik fase diam

4. Ekslusi ukuran (bahasa kerennya: Size Exclusion Chromatography)

Prinsip kerjanya pemisahan analit berdasarkan ukuran. Biasanya pake fase diam dengan pori berukuran tertentu.

Jadi ntar saat elusi, molekul yang kecil akan masuk ke pori fase diam. semakin kecil maka dapat masuk semakin dalam. sedangkan molekul yg besar dia g bisa masuk ke pori sehingga langsung terelusi. Kesimpulannya: Partikel dengan ukuran besar (BM besar) memiliki tR lebih kecil daripada partikel dengan ukuran kecil (BM kecil)